HPLC-menetelmien optimointi parempaan erotteluun ja tarkkuuteen

Tekninen opas laboratoriojohtajille, menetelmäkehittäjille ja HPLC-hankintaryhmille

Parempi HPLC-erotus saadaan harvoin vaihtamalla yhtä asetusta satunnaisesti. Aloita määrittelemällä kriittinen pari, vaadittu raportointiraja ja hyväksymiskriteerit; sitten seulotaan selektiivisyys, orgaaninen koostumus, pH, virtausnopeus, ruiskutuskuorma ja lämpötila tässä järjestyksessä. Rutiinityössä vakaa isokraattinen menetelmä on usein helpompi siirtää ja validoida. Kun myöhään eluoituvat yhdisteet tai laaja polariteettialue tekevät ajoajasta liian pitkän, gradientti voi olla perusteltua. Käytännön tavoite on menetelmä, joka ratkaisee kriittiset huiput toistettavalla retentiolla ja piikin alueella, samalla kun pysyy instrumentin paineen, ilmaisimen, kolonnin ja näyterajoitusten sisällä.

1. Määritä erotusongelma ennen olosuhteiden muuttamista

Kirjaa oireet muistiin: yhteiseluointi, pyrstö, ajautumisen pidättäminen, vastapaine, heikko vaste tai liiallinen ajoaika. Tunnista piikkipari, jolla on merkitystä julkaisun tai tutkimuspäätöksen kannalta. Pienen epäpuhtauden parantaminen uhraamalla tuo pari ei ole parannus.

Aseta mitattavissa olevat tavoitteet: retention toistettavuus, alueen tarkkuus, kriittisen parin resoluutio, pyrstö, levyt ja sykliaika. Kirjaa näytteen liuotin, pitoisuus, injektiotilavuus, kolonnin mitat, lisäaineet ja aallonpituus, jotta selektiivisyyden muutokset voidaan erottaa valmisteen vaihtelusta.

2. Muuta ensin selektiivisyys: kolonnin kemia, pH ja orgaaninen liuotin

Selektiivisyydellä on yleensä enemmän vipuvaikutusta kuin pienellä virtausnopeuden säädöllä. Käänteisfaasimäärityksissä vertaa stationäärisiä faaseja kontrolloituihin mittoihin ja hiukkaskokoon. C18 on hyödyllinen lähtökohta, ei yleinen vastaus; emäksiset, happamat ja erittäin polaariset analyytit saattavat tarvita toisen faasin tai lisäainejärjestelmän.

Säädä pH määritetyllä puskurilla ja varmista, että lopullinen pH on mitattu tarkoitetusta vesipitoisesta komponentista. Pienet pH-muutokset voivat muuttaa analyytin ionisaatiota ja siten retentiota ja selektiivisyyttä. Pidä puskurin pitoisuus, valmistusjärjestys, suodatus ja varastointi yhdenmukaisina. Jos menetelmässä käytetään haihtuvia lisäaineita, tarkista ilmaisimen yhteensopivuus ja lähteen puhtaus ennen tulosten vertailua.

Seulaliuottimen tunniste ja suhde erikseen. Asetonitriilillä ja metanolilla voi olla erilainen selektiivisyys samalla eluutiovoimakkuudella. Muuta yksi tekijä kerrallaan tai käytä pientä mallia ja vahvista sitten tulos uudella mobiilifaasilla. Vahvempi liuotin voi lyhentää ajoa, mutta puristaa kriittistä paria.

3. Valitse isokraattinen tai gradienttitoiminto tarkoituksella

Käytä isokraattista eluointia, kun näytteellä on kapea retentioikkuna ja siirron yksinkertaisuus on tärkeää. Jatkuva koostumus yksinkertaistaa tasapainotusta ja vianetsintää. Gradienttieluointi auttaa, kun varhaiset huiput tarvitsevat heikkoja olosuhteita, mutta myöhäiset yhdisteet luovat pitkän hännän; se lisää viipymätilavuus- ja uudelleentasapainomuuttujia.

Isokraattista työtä varten optimoi orgaaninen prosenttiosuus kriittisen parin ympärillä ja varmista riittävä ensimmäisen huipun säilyminen. Gradienttia varten määritä aloituskoostumus, ramppi, pesu- ja uudelleentasapainotusaika. Jos viipymätilavuudet vaihtelevat instrumenttien välillä, sovita aika kolonnin sisääntulossa sen sijaan, että kopioit vain ohjelmoidun taulukon.

4. Säädä virtausnopeutta ja painetta ohjatussa ikkunassa

Virtausnopeus vaikuttaa tehokkuuteen, paineeseen ja analyysiaikaan. Aloita lähellä kolonnin toimittajan suosittelemaa aluetta ja testaa sitten kapeaa matalasta korkeaan ikkunaa tarkkailemalla resoluutiota ja vastapainetta. Pienempi virtaus voi parantaa tehokkuutta joissakin olosuhteissa, mutta pidentää ajoa; suurempi virtaus voi lisätä läpimenoa ja samalla vähentää tehokkuutta tai ylittää painerajan. Käsittele painetta kovana toimintarajoitteena, älä suoritustavoitteena.

ChroMini HPLC LC-80MI:n virtausnopeusalue on 0,001-5,000 ml/min, virtaustarkkuus <= +/-0,1 % ilmoitetuissa testiolosuhteissa, virtaustarkkuus RSD <=0,5 % ja maksimipaine 5800 psi. Nämä julkaistut arvot auttavat määrittämään instrumentin puoleisen seulontaikkunan, mutta ne eivät korvaa vahvistusta siitä, että valitsemasi kolonni, viskositeetti, lämpötila ja liikkuva faasi pysyvät turvallisissa rajoissa. Tallenna paine lopullisella menetelmällä, tasapainotuksen jälkeen ja puhtaalla järjestelmällä, jotta tuleva ajautuminen on helpompi diagnosoida.

5. Yhdistä injektio, detektio ja lämpötila näytteeseen

Injektiotilavuus ja liuottimen vahvuus voivat aiheuttaa rintaman, halkeamisen tai vääristyneen varhaisen piikin. Älä säilytä näyteliuotinta vahvempana kuin alkuperäinen liikkuva vaihe, kun se on mahdollista, vähennä injektiotilavuutta ylikuormitettujen huippujen varalta ja vahvista pitoisuus ilmaisimen lineaarista toiminta-aluetta vasten. Valmista rinnakkaiset pullot samasta liuoksesta ennen kromatografisten olosuhteiden muuttamista; Muuten valmistuksen vaihtelevuus voi naamioitua erotteluongelmaksi.

Aseta UV-aallonpituus analyytin spektristä tai validoidusta menetelmästä, ei yleisestä oletusarvosta. Wincom LC-80MI määrittää UV-ilmaisimen alueeksi 190-680 nm ja aallonpituuden tarkkuuden +/-1 nm ja tarkkuuden alle 0,1 nm. Nämä ovat hyödyllisiä instrumenttitietoja menetelmän suunnittelussa, kun taas todellinen herkkyys riippuu edelleen analyytin absorptiosta, konsentraatiosta, virtauskenno-olosuhteista ja kohinasta koko menetelmässä.

Lämpötila voi stabiloida viskositeetin ja retention, mutta se ei automaattisesti paranna huonoa selektiivisyyttä. LC-80MI:n termostoitu kolonniosasto on valinnainen. Varmista sen kantama, vakaus, kalibrointitodisteet ja yhteensopivuus kolonnisi ja mobiilifaasisi kanssa ennen kuin määrität sen.

6. Tarkista optimoitu menetelmä järjestelmän soveltuvuuden ja kestävyyden tarkistuksilla

Kun olet valinnut olosuhteet, suorita toistetut standardi- tai järjestelmän soveltuvuusinjektiot. Määritä rajat ennen tulosten tarkastelua. Seuraa kriittisten parien resoluutiota, retention toistettavuutta, alueen tarkkuutta, pyrstöä ja levylukua. Ruiskuta aihio siirtoa varten ja edustava matriisivalmistelu häiriötä varten.

Testaa kestävyyttä asetusarvon ympärillä orgaanisen prosenttiosuuden, pH:n, virtauksen, lämpötilan, aallonpituuden ja ruiskutustilavuuden suhteen. Käytä realistisia muutoksia ja tunnista ensin kriittistä tulosta uhkaava muuttuja. Asiakirjan sarakeerä, liikkuvan vaiheen valmistelu, tasapainotustilavuus, konfigurointi ja käsittelysäännöt.

⭐ Suositeltu kompakti HPLC-järjestelmä | Wincom ChroMini HPLC LC-80MI

ChroMini HPLC LC-80MI on all-in-one isokraattinen järjestelmä, jossa yhdistyvät LC-80-pumppu, UV80-ilmaisin, 7725i manuaalinen injektori, WS-80-työasema ja C18 5 µm ID 4,6 × 250 mm kolonni. Sen konfiguraatio tarjoaa 0,001-5,000 ml/min virtauksen ohjauksen, 5800 psi:n maksimipaineen ja UV-ilmaisun 190-680 nm:ssä.

Käytä ChroMini HPLC LC-80MI -tuotesivu tarkistaaksesi luetellut kokoonpanot, lähetä meille analyyttisi nimet, kolonnikemia, liikkuvan vaiheen resepti, pitoisuus, injektiotilavuus, tavoiteresoluutio ja odotettu näytteen läpijuoksu meidän kauttamme. yhteydenottosivu . Voimme sitten varmistaa, onko julkaistu konfiguraatio sopiva lähtökohta, tarvitaanko valinnainen termostoitu kolonniosasto ja mitkä asiakirjat tai lisävarusteet tulisi sisällyttää tarjoukseen.

Menetelmän optimointitarkistukset yhdellä silmäyksellä

UKK:

Milloin minun pitäisi vaihtaa isokraattisesta gradientti-HPLC:hen?

Vaihda, kun vakiokoostumus ei pysty säilyttämään varhaisia ​​yhdisteitä riittävästi ja eluoi myöhäisiä yhdisteitä kohtuullisessa sykliajassa tai kun selektiivisyys näytealueella on edelleen heikko. Jos siirron yksinkertaisuus ja rutiininomaisuus hallitsevat, säilytä isokraattinen menetelmä, jossa se täyttää kriittisen parin tavoitteen. Voimme tarkistaa ehdotetun gradientin sarakkeen mitoilla, viipymätilavuudella ja uudelleentasapainotusvaatimuksella HPLC-laitteiden luokka .

Voiko LC-80MI tukea menetelmää, joka vaatii UV-ilmaisun alle 200 nm:ssä?

Julkaistu UV80-alue on 190-680 nm, joten menetelmä, joka vaatii aallonpituuden kyseisellä aikavälillä, on ilmoitetun ilmaisinalueen sisällä. Vahvista analyytin vaste, liikkuvan vaiheen absorbanssi, virtauskennoolosuhteet ja kohinan hyväksyntä järjestelmän soveltuvuustestillä, ennen kuin käsittelet menetelmää validoiduksi. Katso LC-80MI:n tekniset tiedot .

Sopiiko mukana toimitettu C18-kolonni jokaiseen HPLC-määritykseen?

Ei. Luettelo C18 5 µm, 4,6 × 250 mm -kolonni on määritelty aloituskonfiguraatio, ei todiste yleisestä analyyttien yhteensopivuudesta. Ilmoita analyytin polariteetti, pKa, matriisi, tavoiteresoluutio ja mahdolliset rajoitetut liuottimet, jotta voimme varmistaa, onko mukana toimitettu kolonni asianmukainen vai onko syytä mainita jokin muu stationaarifaasi. Aloita laboratoriolaitteiden valikoima ja sisällytä nämä ehdot kyselyösi.